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引物二聚体形成原因?pcr产物放置一段时间后引物二聚体变多?( 二 )


反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul 。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败 。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率 。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一 。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的 。
假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高 。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列 。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性 。需重新设计引物 。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性 。这种假阳性可用以下方法竖肆解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪世雹内或溅出离心管外 。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒 。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用 。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸 。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性 。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除 。
出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带 。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体 。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过余返轿低，及PCR循环次数 过多有关 。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增 。其对策有：必要时重新设计引 物 。减低酶量或调换另一来源的酶 。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数 。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸) 。
出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带 。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起 。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶 。②减少dNTP的浓度 。适当降低Mg2+浓 度 。增加模板量，减少循环次数 。
克隆PCR产物
1)克隆PCR产物的最优条件是什么？
最佳插入片段：载体比需实验确定 。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行 。应测定比值范围 。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul 。室温保温1小时，或4℃过夜 。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑 。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4℃过夜 。
2)PCR产物是否需要用凝胶纯化？
如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化 。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体 。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段 。为此需在克隆前做凝胶纯化 。
3)如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？
A）涂布未转化的感受态细胞 。
如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落 。
B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率 。
例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化 。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板 。培养过夜，产生1000个菌落 。转化率为： 产生菌落的总数/铺板DNA的总量 。
铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数 。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA 。转化率为：
1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug
转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞
如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低 。


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